Ваша корзина пуста
Выберите в каталоге интересующий товар
и нажмите кнопку «В корзину».
Перейти в каталог
и нажмите кнопку «В корзину».
Заказать звонок
ПРОТИВОВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ КОМПЛЕКСА ОДНОЦЕПОЧЕЧНОЙ ВЫСОКОПОЛИМЕРНОЙ РНК В ОТНОШЕНИИ ВИРУСА БЕШЕНСТВА IN VITRO
Самые читаемые
3 мар 2026
Научный журнал "ВОПРОСЫ БИОЛОГИЧЕСКОЙ, МЕДИЦИНСКОЙ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ ХИМИИ", №8, т.28, 2025
С.В. Генералов к.б.н., вед. науч. сотрудник, лаборатория профилактических иммуноглобулинов
Перевозников магистрант, лаборант-исследователь, лаборатория профилактических иммуноглобулинов
Е.Г. Абрамова д.б.н., зав. лабораторией профилактических иммуноглобулинов
Никифоров д.б.н., профессор, зам. директора по экспериментальной и производственной работе
Спицын А.А. гл. науч. сотрудник
Потупчик к.м.н., доцент кафедры фармакологии и клинической фармакологии с курсом постдипломного образования
Е.М. Шендерович лаборант-исследователь, лаборатория индикации и ультраструктурного анализа микроорганизмов
ФКУН «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека; Российская Федерация, 410005, г. Саратов, ул. Университетская,
ФГБОУ ВО«Саратовский государственный университет генетики, биотехнологии и инженерии имени Н.И. Вавилова»; Российская Федерация, 410012, г. Саратов, проспект им. Петра Столыпина зд. 4, стр. 3
ООО«НПО «Эволюция Природы»; Российская Федерация, 630102 г. Новосибирск, ул. Восход 20/1, помещение 1.2
ФГБОУ ВО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России; Российская Федерация, 660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, д. 1 5
ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России; Российская Федерация, 123098, Москва, ул. Гамалеи, дом 18
Введение
Бешенство является инфекционным заболеванием с абсолютной летальностью. В настоящее время не существует эффективных лекарств и схем лечения людей с признаками бешенства. Единственной стратегией постэкспозиционной профилактики бешенства является вакцинация и введение антирабического иммуноглобулина. При этом сохраняется актуальность поиска новых схем лечения и профилактики заболевания, вследствие чего важным является разработка и исследование противовирусных препаратов, эффективных против вируса бешенства.
Цель исследования– изучение противовирусной активности препарата на основе одноцепочечной высокополимерной РНК Sacharomyces cerevisiae, ранее показавшей противовирусную активность в отношении других возбудителей вирусных инфекций.
Материал и методы. В работе исследовали влияние препарата на основе одноцепочечной высокополимерной РНК S. cerevisiae Амфиэвовир на уровень репродукции аттенуированного штамма вируса бешенства «Саратов» на модели культуры клеток Vero.
Результаты. Исследуемый препарат в диапазоне концентраций от 10 до 20 мкг/мл и внесении в культуру клеток не позднее, чем через 24 ч после инфицирования, снижает титр вируса на уровне от 24,6 до 36,2% по сравнению с контрольной группой. Внесение препарата в инфицируемую культуру клеток позднее 24 ч снижает его противовирусный эффект.
Выводы. Исследуемый препарат на основе одноцепочечной высокополимерной РНК S. cerevisiae обладает противовирусной активностью в отношении вируса бешенства в условиях in vitro. Результаты позволяют обосновать дальнейшее изучение схем постэкспозиционной профилактики бешенства с использованием препаратов, изготовленных на основе иммуностимулирующих и иммуномодулирующих РНК.
Ключевые слова: РНК иммуномодулирующая, РНК иммуностимулирующая, вирус бешенства, культура клеток, противовирусная активность.
ВВЕДЕНИЕ
Бешенство является известным инфекционным заболеванием, общим для человека и теплокровных животных, с абсолютной летальностью. Болезнь вызывает Rabies virus (RABV), который принадлежит к роду Lyssavirus и семейству Rhab-doviridae. Геном вируса представляет собой одиночную отрицательно-цепочечную РНК размером приблизительно 12 кб, кодирующую пять структурных белков. Попадание вируса бешенства в организм человека, как правило, связано с укусами инфицированных диких или домашних животных [1]. К настоящему времени единственным одобренным Всемирной организацией здравоохранения в стратегии борьбы с бешенством специфическим средством является введение антирабической вакцины, а также дополнительное введение антирабического иммуноглобулина при значительных повреждениях кожи в результате укуса или при подозрении попадания слюны инфицированного животного на слизистые оболочки. Мероприятия, связанные с введением специфических вакцины и иммуноглобулина, являются строго профилактическими. Эффективность специфической постэкспозиционной профилактики во многом зависит от сроков введения препаратов после контакта с бешеным животным. Отсутствие специфической профилактики так же, как и неправильное ее проведение, как правило, приводит к проявлению признаков болезни и последующему летальному исходу [2]. Для лечения бешенства к настоящему времени не разработано ни одного эффективного лекарственного препарата. Тем не менее поиск новых средств для профилактики и лечения бешенства является актуальной задачей, которой посвящено достаточное количество публикаций [3–9]. В качестве ингибиторов вируса бешенства исследованы различные соединения: вирозол, линкомицин, ремантадин, рифампицин, резерпин, бензонал и др. Введение этих препаратов лабораторным животным обеспечивало их выживаемость на 30–75% по сравнению с контрольной группой, а инкубационный период удлинялся в 2 раза и более [4]. В Республике Беларусь для постэкспозиционного лечения бешенства разрешено комплексное примененение антирабической вакцины и рифампицина, низкомолекулярного соединения, получаемого из культуральной жидкости грибка Streptomycenes medioterranei. Исследователями показано, что рифампицин эффективно подавляет репродукцию
вируса бешенства, препятствует его проникновению в центральную нервную систему, что приводит к повышению эффективности действия вакцины [4, 5]. Данное обстоятельство позволило внедрить в практику сухую культуральную антирабическую вакцину «Рабириф», в состав которой входит рифампицин. Положительные результаты при исследовании ингибирующего влияния на вирус бешенства показаны в отношении фавипиравира (6-фтор-3-гидрокси-2-пиразинкарбоксамида, Т-705) [6]. Более эффективное ингибирующее действие на вирус бешенства показали производные клофазимина, препарата, используемого для лечения лепры [7]. Большой интерес для профилактики и лечения бешенства могут представлять соединения на основе нуклеозидов, нуклеотидов и нуклеиновых кислот [3, 8, 9]: CpG-олигонуклеотиды, интерферирующие РНК (siРНК), малые шпилечные РНК (shРНК), аптамеры и др. [10, 11], которые показали эффект в отношении различных возбудителей вирусных заболеваний, в том числе и RABV. Использование рибавирина (производное гуанинового нуклеотида) в комбинации с кетамином, амантадином, мидазоламом и фенобарбиталом вошло в схему комбинированного лечения больных бешенством, известного как «Милуокский протокол». Несмотря на высокую стоимость и недоказанную эффективность, его следует рассматривать как этап на пути к разработке более совершенных методов лечения [12]. Исследования интерферирующих РНК и аптамеров также показали эффективность в отношении ингибирования репродукции вируса бешенства на культуре клеток [9]. На сегодняшний день внедрены в практику различные препараты на основе иммуностимулирующих и иммуномодулирующих РНК. В качестве примеров к таким препаратам следует отнести зарубежные «Ampligen» и RGC100. В Российской Федерации также разработаны: препарат «Ларифан», действующим средством которого является репликативная двуспиральная РНК бактериофага F2, поражающего бактерию E. сoli; препараты на основе двуцепочечной РНК дрожжей «Ридастин», «Вестин», а также комплексный препарат «Рибомикс», сочетающий в своем составе однонитевую РНК и двуспиральную РНК дрожжей и двуспиральную РНК бактериофага φ6 [10, 11]. Известны исследования по изучению эффективности препарата «Радамин Виро», изготвленного на основе натриевой соли двуцепочечной РНК, в отношении SARS-CoV-2. [13]. Высокую активность против широкого спектра вирусов (вирус оспы, вирус ринотрахеита, возбудители гепатитов, вирусной диареи) показали ветеринарные препараты серии «Виталанг», действующим веществом которых является амфифильный комплекс одноцепочечной высокополимерной РНК пекарских дрожжей [14, 15]. Аналогичное действующее вещество также используется при производстве биологической активной добавки Амфиэвовир. Следует отметить, что публикации по изучению действия подобных препаратов российского производства на RABV отсутствуют. Широкая противовирусная активность препаратов на основе иммуностимулирующих и иммуномодулирующих РНК позволила определить задачу настоящей работы – оценить влияние препарата, изготовленного на основе одноцепочечной высокополимерной РНК пекарских дрожжей, на репродукцию вируса RABV в условиях in vitro с целью поиска эффективных средств для профилактики и лечения бешенства.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Вирус.
В экспериментах использовали штамм аттенуированного вируса бешенства «Саратов» (альтернативное название «Москва 3253» Vero), полученный в результате адаптации производственного штамма «Москва 3253» к культуре клеток Vero.
Культура клеток. В исследовании использовали перевиваемую культуру клеток почки зеленой мартышки Vero. Клетки культивировали в среде 199 с двойным набором аминокислот (ООО «БиолоТ», Россия) с добавлением 10% сыворотки КРС (ООО «БиолоТ», Россия) при 37 °С и 5% СO2. Для культивирования клеток использовали культуральные флаконы (Jet Biofil, Китай) с площадью рабочей поверхности 25 и 75 см2. Для пересева клеточных культур применяли растворы Дальбекко (ООО «БиолоТ», Россия), трипсина (ООО «БиолоТ», Россия) и версена (ООО «БиолоТ», Россия). Исследуемый препарат: Амфиэвовир (НПО «Эволюция природы», Россия), лиофилизат для приготовления раствора для внутримышечного введения. Активное вещество препарата – комплекс, содержащий односпиральную РНК Saccharomyces cerevisiae.
Определение активности вируса бешенства. Для определения активности вируса бешенства выполняли титрование вируссодержащей жидкости в 96-луночных планшетах (Jet Biofil, Китай) по меньшей мере в четырёх рядах. Затем в лунки планшета добавляли клеточную культуру в концентрации (1,5±0,5)×104 кл/мл и инкубировали в СО2-инкубаторе в течение 3 суток. После завершения инкубации клетки фиксировали 80%-ным ацетоном, промывали фосфатным буферным раствором (рН 7,2, 0,1 моль/л) и окрашивали флуоресцирующими антирабическими антителами (ВНИИЗЖ, Россия). Учет осуществляли с помощью микроскопа «Микромед И-ЛЮМ» (Микромед, Россия). В клеточном монослое, инфицированном вирусом бешенства, наблюдали специфическое жёлто-зелёное свечение. Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча.
Определение рабочей концентрации препарата Амфиэвовир. Препарат разводили в среде 199 до концентрации 5,0 мг/мл. Препарат в указанном разведении титровали в лунках 96луночного планшета, соблюдая, чтобы общий объем составлял 100 мкл. Затем в каждую лунку добавляли 50 мкл суспензии, содержащей (1,5±0,5)×104 кл/мл. Параллельно подготавливали контрольную группу с клеточной культурой без содержания исследуемого препарата. Планшет с клетками инкубировали в СО2-инкубаторе в течение 5 дней с ежедневным контролем за состоянием клеточного монослоя. Для работы выбирали концентрацию препарата, при которой к концу срока эксперимента отсутствовало проявление морфологических изменений клеточной культуры, отличающееся от контрольной группы. Исследование противовирусного действия препарата Амфиэвовир. Противовирусное действие препарата исследовали in vitro двумя способами. Первый способ заключался в предварительной нейтрализации вируса бешенства Амфиэвовиром. Для этого в лунках 96-луночного планшета готовили разведения вируса бешенства и добавляли разведения Амфиэвовира в исследуемых концентрациях. В контрольную группу Амфиэвовир не добавляли. Полученную смесь выдерживали в течение 1 ч при 37 ºС, после чего в лунки планшета добавляли клеточную суспензию и инкубировали в СО2-инкубаторе в течение 3 суток. По завершении срока инкубации определяли титр вируса, как описано в разделе «Определение активности вируса бешенства».
Второй способ заключался предварительном инфицировании клеточной культуры Vero разведениями вируса бешенства так, как описано в разделе «Определение активности вируса бешенства». Через 24–48 ч после инфицирования монослоя среду с вирусом удаляли, клетки промывали раствором Дальбекко и добавляли к ним питательную среду, содержащую Амфиэвовир. Аналогичную манипуляцию проводили с интактными клетками. Так же исследовали контрольные группы интактных и инфицированных клеток, в которых питальную среду не меняли на протяжении времени наблюдения. В конце эксперимента клеточный монослой окрашивали флуоресцентными антирабическими антителами и определяли титр вируса согласно предыдущему описанию.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Определение рабочей концентрации Амфиэвовира осуществляли в диапазоне от 4,0 до 0,005 мг/мл. Через 24 ч после инкубирования в лунках с концентрацией Амфиэвовира более 0,1 мг/мл отмечали деструктивные изменения монослоя, которые выражались как в разрушении всего монослоя, так и в изменении формы клеток. В следующие 24 ч продолжали наблюдать незначительные изменения форм клеток в лунках с концентрацией исследуемого препарата от 0,03 до 0,1 мг/мл, которые исчезали при дальнейшем культивировании. Подобный эффект может быть связан со вспомогательными веществами, содержащимися в препарате и влияющими на кислотность среды. На данном этапе была установлена максимальная рабочая концентрация Амфиэвовира, равная 20 мкг/мл. Для последующих экспериментов использовали разведения Амфиэвовира, значения которых составили 20 и 10 мкг/мл. Результаты экспериментов по определению противовирусной активности исследуемого препарата показаны на рис. 1–3. На рис. 1 представлены данные по изучению нейтрализующих свойств препарата вне клетки. Установлено, что препарат Амфиэвовир в концентрации более 10 мкг/мл снижает активность вируса бешенства при взаимодействии вне клетки, уровень редукции активности при использовании доз 10 и 20 мкг/мл соответствовал значениям 12,4 и 19,1% относительно инфицирующей активности вируса бешенства в контрольной группе. При этом коэффициент вариации составил не более 15%.
Рис. 1. Нейтрализующее действие Амфиэвовира на вирус бешенства (число экспериментов для каждой группы n=3) Fig. 1. Neutralizing effect of amphivoir on rabies virus (number of experiments for each group n=3)
Рис. 2. Исследование противовирусной активности на инфицированной культуре клеток (число экспериментов для каждой группы n=3) Fig. 2. Study of antiviral activity on infected cell culture (number of experiments for each group n=3)
Результаты экспериментов по исследованию влияния Амфиэвовира на инфицированную клеточную культуру показаны на рис. 2. В этой серии экспериментов изучали действие Амфиэвовира в дозах 20 и 10 мкг/мл. Препарат добавляли в клеточный монослой через 24 ч после начала инфицирования вирусом бешенства. Перед обработкой монослоя полностью удаляли питательную среду и однократно отмывали раствором Дульбекко. Аналогичную процедуру осуществляли для второй контрольной группы, в которую добавляли питательную среду без добавления Амфиэвовира. В первой контрольной группе замену среды не проводили. Результаты показали несущественные различия между двумя контрольными группами. Данное обстоятельство свидетельствует о том, что замена среды в инфицированном монослое практически не влияет на титр вируса бешенства, определяемый используемым методом. При этом в обеих опытных группах наблюдали значительное снижение титра вируса. Уровень редукции вирусной активности по сравнению с первой контрольной группой соответствовал значениям 24,6 и 36,2% для коцентраций Амфиэвовира 10 и 20 мкг/мл. Коэффициент вариации в настоящем эксперименте не превышал 5%. В следующем эксперименте, результаты которого представлены на рис. 3, оценивали эффект времени с момента инфицирования клеточной культуры до добавления исследуемого препарата. В экспериментах использовали концентрацию препарата, равную 20 мкг/мл. Препарат в исследуемой концентрации добавляли к клеточному монослою через 24, 48 и 72 ч после его инфицирования аналогично предыдущему эксперименту. Общий срок наблюдения составил 4 суток. Результаты, представленные на рис. 3, свидетельствуют, что противовирусное действие исследуемого препарата зависит от времени, прошедшего с момента инфицирования.
Рис. 3. Исследование противовирусного эффекта на инфицированной культуре клеток в зависимости от времени внесения (число экспериментов для каждой группы n=3) Fig. 3. Study of the antiviral effect on the infected cell culture depending on the time of application (number of experiments for each group n=3)
При этом наибольший противовирусный эффект имел место при более раннем воздействии на инфицированный объект. Так, добавление Амфиэвовира к монослою Vero через 24 ч после его инфицирования вирусом бешенства позволило снизить уровень репродукции последнего на 25%. Увеличение времени внесения до 48 ч снижало его эффективность практически в два раза, а обработка монослоя Амфиэвовиром через 72 ч после инфицирования практически не оказывала противовирусного воздействия.
ВЫВОДЫ
Препарат Амфиэвовир, изготовленный на основе комплекса однонитевой РНК S. cerevisiae в концентрациях от 10 до 20 мкг/мл, не оказывает токсического воздействия на клеточную культуру, снижает инфекционную активность вируса бешенства в условиях in vitro, а также задерживает его репродукцию в инфицированной культуре клеток Vero. Установлено, что эффект снижения репродукции вируса бешенства обратно зависит от срока инфицирования клеточной культуры. Полученные данные свидетельствуют о противовирусном действии исследуемого препарата in vitro в отношении вируса бешенства. Результаты позволяют обосновать дальнейшие исследования при изучении схем профилактики бешенства с использованием препаратов, изготовленных на основе иммуностимулирующих и иммуномодулирующих РНК. Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи. Conflicts of Interest. The authors declare no obvious or potential conflicts of interest related to the publication of this article.
ЛИТЕРАТУРА
1. Zheng J., Sui B., Zhao L. Rabies lyssavirus. Veterinary Virology of Domestic and Pet Animals. Cham: Springer Nature Switzerland, 2025; 1–19. 2. WHO Expert Consultation on Rabies, third report. Geneva: World Health Organization; 2018 (WHO Technical Report Series, No. 1012). 195 3. Lacy M., Phasuk N., Scholand S.J. Human Rabies Treatment – From Palliation to Promise. Viruses. 2024; 16(1): 160. DOI: 10.3390/v16010160 4. Ковалев Н.А., Бучукури Д.В. Изучение бешенства и разработка средств и способов его профилактики в Беларуси. Весці Нацыянальнай акадэміі навук Беларусі. Серыя аграрных навук. 2014; 4: 96–102. 5. Бучукури Д.В., Ковалев Н.А., Ломако Ю.В. и др. Вакциносодержащая безблистерная приманка для пероральной иммунизации плотоядных животных против бешенства. Известия Национальной академии наук Беларуси. Серия аграрных наук. 2019;
6. Yamada K., Noguchi K., Kimitsuki K., et al. Reevaluation of the efficacy of favipiravir against rabies virus using in vivo imaging analysis. Antiviral Res. 2019; 172: 104641. DOI: 10.1016/j.antiviral.2019.104641. 7. Wu J., Cao S., Lei S., et al. Clofazimine: a promising inhibitor of rabies virus. front pharmacol. 2021; 12: 598241. DOI: 10.3389/fphar.2021.598241. 8. Scott T.P., Nel L.H. Rabies prophylactic and treatment options: an in vitro study of sirna- and aptamer-based therapeutics. Viruses. 2021; 13(5): 881. DOI: 10.3390/v13050881 9. Brandão P.E., Castilho J.G., Fahl W., et al. Short-interfering RNAs as antivirals against rabies. Braz. J. Infect. Dis. 2007; 11(2): 224–225. DOI: 10.1590/s1413-86702007000200011. 10. Ермолаев В.В., Шимина Г.Г., Аликин Ю.С. и др. Новые препараты иммуномодуляторов на основе РНК для лечения вирусных инфекций. Инновации и продовольственная безопасность. 2023; 4: 78–89. DOI.org/10.31677/23110651-2023-42-4-78-89. 11. Даниленко Е.Д., Белкина А.О., Сысоева Г.М. Создание лекарственных препаратов на основе высокополимерных двуспиральных РНК для противовирусной и противоопухолевой
терапии. Биомедицинская химия. 2019; 65(4): 277–293. 12. Старков Ф.И., Шалин В.В., Миронов В.С., Миронов А.В. Милуокский протокол – от идеи до реализации. Медицинский вестник Юга России. 2023; 14(3): 59–65. DOI: 10.21886/2219-8075-2023-14-3-59-65. 13. Игнатьев Г.М., Шустова Е.Ю., Рогожина Е.А. и др. Противовирусная активность лекарственного препарата на основе РНК двуспиральной натриевой соли в отношении SARS-CoV-2 in vitro. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2023; 23(3): 290–299. DOI: 10.30895/2221-996X-2023-23-3-290-299. 14. Ямковая Т.В., Мазуркова Н.А., Загребельный С.Н. и др. Способ лечения оспы. Патент № 2480219. опубл. 27.04.2013. Бюл. №12. 15. Ямковая Т.В., Глотова Т.И., Колесникова О.П. и др. Легко проникающий через биологические мембраны мылкий амфифильный индуктор интерферона γ-перспективный препарат для лечения гепатита с человека. Сибирский научный медицинский журнал. REFERENCES 1. Zheng J., Sui B., Zhao L. Rabies lyssavirus. Veterinary Virology of Domestic and Pet Animals. Cham: Springer Nature Switzerland, 2025; 1–19. 2. WHO Expert Consultation on Rabies, third report. Geneva: World Health Organization; 2018 (WHO Technical Report Series, No. 1012). 195 3. Lacy M., Phasuk N., Scholand S.J. Human Rabies Treatment – From Palliation to Promise. Viruses. 2024; 16(1):160. DOI: 10.3390/v16010160 4. Kovalev N.A., Buchukuri D.V. Izuchenie beshenstva i razrabotka sredstv i sposobov ego profilaktiki v Belarusi. Vescі Nacyyanal'naj akademіі navuk Belarusі. Seryya agrarnyh navuk. 2014; 4: 96–102. (In Russ.). 5. Buchukuri D.V., Kovalev N.A., Lomako Yu.V. i dr. Vakcinosoderzhashchaya bezblisternaya primanka dlya peroral'noj immunizacii plotoyadnyh zhivotnyh protiv beshenstva. Izvestiya Nacional'noj akademii nauk Belarusi. Seriya agrarnyh nauk. 2019; 57(3): 334–343. (In Russ.). 6. Yamada K., Noguchi K., Kimitsuki K., et al. Reevaluation of the efficacy of favipiravir against rabies virus using in vivo imaging analysis. Antiviral Res. 2019; 172: 104641. DOI: 10.1016/j.antiviral.2019.104641. 7. Wu J., Cao S., Lei S., et al. Clofazimine: a promising inhibitor of rabies virus. front pharmacol. 2021; 12: 598241. DOI: 10.3389/fphar.2021.598241. 8. Scott T.P., Nel L.H. Rabies prophylactic and treatment options: an in vitro study of sirna- and aptamer-based therapeutics. Viruses. 2021; 13(5): 881. DOI: 10.3390/v13050881 9. Brandão P.E., Castilho J.G., Fahl W., et al. Short-interfering RNAs as antivirals against rabies. Braz. J. Infect. Dis. 2007; 11(2): 224–225. DOI: 10.1590/s1413-86702007000200011. 10. Ermolaev V.V., Shimina G.G., Alikin Yu.S. i dr. Novye preparaty immunomodulyatorov na osnove RNK dlya lecheniya virusnyh infekcij. Innovacii i prodovol'stvennaya bezopasnost'. 2023; 4: 78–89. DOI.org/10.31677/2311-0651-2023-42-4-78-89. (In Russ.).
Перевозников магистрант, лаборант-исследователь, лаборатория профилактических иммуноглобулинов
Е.Г. Абрамова д.б.н., зав. лабораторией профилактических иммуноглобулинов
Никифоров д.б.н., профессор, зам. директора по экспериментальной и производственной работе
Спицын А.А. гл. науч. сотрудник
Потупчик к.м.н., доцент кафедры фармакологии и клинической фармакологии с курсом постдипломного образования
Е.М. Шендерович лаборант-исследователь, лаборатория индикации и ультраструктурного анализа микроорганизмов
ФКУН «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека; Российская Федерация, 410005, г. Саратов, ул. Университетская,
ФГБОУ ВО«Саратовский государственный университет генетики, биотехнологии и инженерии имени Н.И. Вавилова»; Российская Федерация, 410012, г. Саратов, проспект им. Петра Столыпина зд. 4, стр. 3
ООО«НПО «Эволюция Природы»; Российская Федерация, 630102 г. Новосибирск, ул. Восход 20/1, помещение 1.2
ФГБОУ ВО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России; Российская Федерация, 660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, д. 1 5
ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России; Российская Федерация, 123098, Москва, ул. Гамалеи, дом 18
Введение
Бешенство является инфекционным заболеванием с абсолютной летальностью. В настоящее время не существует эффективных лекарств и схем лечения людей с признаками бешенства. Единственной стратегией постэкспозиционной профилактики бешенства является вакцинация и введение антирабического иммуноглобулина. При этом сохраняется актуальность поиска новых схем лечения и профилактики заболевания, вследствие чего важным является разработка и исследование противовирусных препаратов, эффективных против вируса бешенства.
Цель исследования– изучение противовирусной активности препарата на основе одноцепочечной высокополимерной РНК Sacharomyces cerevisiae, ранее показавшей противовирусную активность в отношении других возбудителей вирусных инфекций.
Материал и методы. В работе исследовали влияние препарата на основе одноцепочечной высокополимерной РНК S. cerevisiae Амфиэвовир на уровень репродукции аттенуированного штамма вируса бешенства «Саратов» на модели культуры клеток Vero.
Результаты. Исследуемый препарат в диапазоне концентраций от 10 до 20 мкг/мл и внесении в культуру клеток не позднее, чем через 24 ч после инфицирования, снижает титр вируса на уровне от 24,6 до 36,2% по сравнению с контрольной группой. Внесение препарата в инфицируемую культуру клеток позднее 24 ч снижает его противовирусный эффект.
Выводы. Исследуемый препарат на основе одноцепочечной высокополимерной РНК S. cerevisiae обладает противовирусной активностью в отношении вируса бешенства в условиях in vitro. Результаты позволяют обосновать дальнейшее изучение схем постэкспозиционной профилактики бешенства с использованием препаратов, изготовленных на основе иммуностимулирующих и иммуномодулирующих РНК.
Ключевые слова: РНК иммуномодулирующая, РНК иммуностимулирующая, вирус бешенства, культура клеток, противовирусная активность.
ВВЕДЕНИЕ
Бешенство является известным инфекционным заболеванием, общим для человека и теплокровных животных, с абсолютной летальностью. Болезнь вызывает Rabies virus (RABV), который принадлежит к роду Lyssavirus и семейству Rhab-doviridae. Геном вируса представляет собой одиночную отрицательно-цепочечную РНК размером приблизительно 12 кб, кодирующую пять структурных белков. Попадание вируса бешенства в организм человека, как правило, связано с укусами инфицированных диких или домашних животных [1]. К настоящему времени единственным одобренным Всемирной организацией здравоохранения в стратегии борьбы с бешенством специфическим средством является введение антирабической вакцины, а также дополнительное введение антирабического иммуноглобулина при значительных повреждениях кожи в результате укуса или при подозрении попадания слюны инфицированного животного на слизистые оболочки. Мероприятия, связанные с введением специфических вакцины и иммуноглобулина, являются строго профилактическими. Эффективность специфической постэкспозиционной профилактики во многом зависит от сроков введения препаратов после контакта с бешеным животным. Отсутствие специфической профилактики так же, как и неправильное ее проведение, как правило, приводит к проявлению признаков болезни и последующему летальному исходу [2]. Для лечения бешенства к настоящему времени не разработано ни одного эффективного лекарственного препарата. Тем не менее поиск новых средств для профилактики и лечения бешенства является актуальной задачей, которой посвящено достаточное количество публикаций [3–9]. В качестве ингибиторов вируса бешенства исследованы различные соединения: вирозол, линкомицин, ремантадин, рифампицин, резерпин, бензонал и др. Введение этих препаратов лабораторным животным обеспечивало их выживаемость на 30–75% по сравнению с контрольной группой, а инкубационный период удлинялся в 2 раза и более [4]. В Республике Беларусь для постэкспозиционного лечения бешенства разрешено комплексное примененение антирабической вакцины и рифампицина, низкомолекулярного соединения, получаемого из культуральной жидкости грибка Streptomycenes medioterranei. Исследователями показано, что рифампицин эффективно подавляет репродукцию
вируса бешенства, препятствует его проникновению в центральную нервную систему, что приводит к повышению эффективности действия вакцины [4, 5]. Данное обстоятельство позволило внедрить в практику сухую культуральную антирабическую вакцину «Рабириф», в состав которой входит рифампицин. Положительные результаты при исследовании ингибирующего влияния на вирус бешенства показаны в отношении фавипиравира (6-фтор-3-гидрокси-2-пиразинкарбоксамида, Т-705) [6]. Более эффективное ингибирующее действие на вирус бешенства показали производные клофазимина, препарата, используемого для лечения лепры [7]. Большой интерес для профилактики и лечения бешенства могут представлять соединения на основе нуклеозидов, нуклеотидов и нуклеиновых кислот [3, 8, 9]: CpG-олигонуклеотиды, интерферирующие РНК (siРНК), малые шпилечные РНК (shРНК), аптамеры и др. [10, 11], которые показали эффект в отношении различных возбудителей вирусных заболеваний, в том числе и RABV. Использование рибавирина (производное гуанинового нуклеотида) в комбинации с кетамином, амантадином, мидазоламом и фенобарбиталом вошло в схему комбинированного лечения больных бешенством, известного как «Милуокский протокол». Несмотря на высокую стоимость и недоказанную эффективность, его следует рассматривать как этап на пути к разработке более совершенных методов лечения [12]. Исследования интерферирующих РНК и аптамеров также показали эффективность в отношении ингибирования репродукции вируса бешенства на культуре клеток [9]. На сегодняшний день внедрены в практику различные препараты на основе иммуностимулирующих и иммуномодулирующих РНК. В качестве примеров к таким препаратам следует отнести зарубежные «Ampligen» и RGC100. В Российской Федерации также разработаны: препарат «Ларифан», действующим средством которого является репликативная двуспиральная РНК бактериофага F2, поражающего бактерию E. сoli; препараты на основе двуцепочечной РНК дрожжей «Ридастин», «Вестин», а также комплексный препарат «Рибомикс», сочетающий в своем составе однонитевую РНК и двуспиральную РНК дрожжей и двуспиральную РНК бактериофага φ6 [10, 11]. Известны исследования по изучению эффективности препарата «Радамин Виро», изготвленного на основе натриевой соли двуцепочечной РНК, в отношении SARS-CoV-2. [13]. Высокую активность против широкого спектра вирусов (вирус оспы, вирус ринотрахеита, возбудители гепатитов, вирусной диареи) показали ветеринарные препараты серии «Виталанг», действующим веществом которых является амфифильный комплекс одноцепочечной высокополимерной РНК пекарских дрожжей [14, 15]. Аналогичное действующее вещество также используется при производстве биологической активной добавки Амфиэвовир. Следует отметить, что публикации по изучению действия подобных препаратов российского производства на RABV отсутствуют. Широкая противовирусная активность препаратов на основе иммуностимулирующих и иммуномодулирующих РНК позволила определить задачу настоящей работы – оценить влияние препарата, изготовленного на основе одноцепочечной высокополимерной РНК пекарских дрожжей, на репродукцию вируса RABV в условиях in vitro с целью поиска эффективных средств для профилактики и лечения бешенства.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Вирус.
В экспериментах использовали штамм аттенуированного вируса бешенства «Саратов» (альтернативное название «Москва 3253» Vero), полученный в результате адаптации производственного штамма «Москва 3253» к культуре клеток Vero.
Культура клеток. В исследовании использовали перевиваемую культуру клеток почки зеленой мартышки Vero. Клетки культивировали в среде 199 с двойным набором аминокислот (ООО «БиолоТ», Россия) с добавлением 10% сыворотки КРС (ООО «БиолоТ», Россия) при 37 °С и 5% СO2. Для культивирования клеток использовали культуральные флаконы (Jet Biofil, Китай) с площадью рабочей поверхности 25 и 75 см2. Для пересева клеточных культур применяли растворы Дальбекко (ООО «БиолоТ», Россия), трипсина (ООО «БиолоТ», Россия) и версена (ООО «БиолоТ», Россия). Исследуемый препарат: Амфиэвовир (НПО «Эволюция природы», Россия), лиофилизат для приготовления раствора для внутримышечного введения. Активное вещество препарата – комплекс, содержащий односпиральную РНК Saccharomyces cerevisiae.
Определение активности вируса бешенства. Для определения активности вируса бешенства выполняли титрование вируссодержащей жидкости в 96-луночных планшетах (Jet Biofil, Китай) по меньшей мере в четырёх рядах. Затем в лунки планшета добавляли клеточную культуру в концентрации (1,5±0,5)×104 кл/мл и инкубировали в СО2-инкубаторе в течение 3 суток. После завершения инкубации клетки фиксировали 80%-ным ацетоном, промывали фосфатным буферным раствором (рН 7,2, 0,1 моль/л) и окрашивали флуоресцирующими антирабическими антителами (ВНИИЗЖ, Россия). Учет осуществляли с помощью микроскопа «Микромед И-ЛЮМ» (Микромед, Россия). В клеточном монослое, инфицированном вирусом бешенства, наблюдали специфическое жёлто-зелёное свечение. Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча.
Определение рабочей концентрации препарата Амфиэвовир. Препарат разводили в среде 199 до концентрации 5,0 мг/мл. Препарат в указанном разведении титровали в лунках 96луночного планшета, соблюдая, чтобы общий объем составлял 100 мкл. Затем в каждую лунку добавляли 50 мкл суспензии, содержащей (1,5±0,5)×104 кл/мл. Параллельно подготавливали контрольную группу с клеточной культурой без содержания исследуемого препарата. Планшет с клетками инкубировали в СО2-инкубаторе в течение 5 дней с ежедневным контролем за состоянием клеточного монослоя. Для работы выбирали концентрацию препарата, при которой к концу срока эксперимента отсутствовало проявление морфологических изменений клеточной культуры, отличающееся от контрольной группы. Исследование противовирусного действия препарата Амфиэвовир. Противовирусное действие препарата исследовали in vitro двумя способами. Первый способ заключался в предварительной нейтрализации вируса бешенства Амфиэвовиром. Для этого в лунках 96-луночного планшета готовили разведения вируса бешенства и добавляли разведения Амфиэвовира в исследуемых концентрациях. В контрольную группу Амфиэвовир не добавляли. Полученную смесь выдерживали в течение 1 ч при 37 ºС, после чего в лунки планшета добавляли клеточную суспензию и инкубировали в СО2-инкубаторе в течение 3 суток. По завершении срока инкубации определяли титр вируса, как описано в разделе «Определение активности вируса бешенства».
Второй способ заключался предварительном инфицировании клеточной культуры Vero разведениями вируса бешенства так, как описано в разделе «Определение активности вируса бешенства». Через 24–48 ч после инфицирования монослоя среду с вирусом удаляли, клетки промывали раствором Дальбекко и добавляли к ним питательную среду, содержащую Амфиэвовир. Аналогичную манипуляцию проводили с интактными клетками. Так же исследовали контрольные группы интактных и инфицированных клеток, в которых питальную среду не меняли на протяжении времени наблюдения. В конце эксперимента клеточный монослой окрашивали флуоресцентными антирабическими антителами и определяли титр вируса согласно предыдущему описанию.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Определение рабочей концентрации Амфиэвовира осуществляли в диапазоне от 4,0 до 0,005 мг/мл. Через 24 ч после инкубирования в лунках с концентрацией Амфиэвовира более 0,1 мг/мл отмечали деструктивные изменения монослоя, которые выражались как в разрушении всего монослоя, так и в изменении формы клеток. В следующие 24 ч продолжали наблюдать незначительные изменения форм клеток в лунках с концентрацией исследуемого препарата от 0,03 до 0,1 мг/мл, которые исчезали при дальнейшем культивировании. Подобный эффект может быть связан со вспомогательными веществами, содержащимися в препарате и влияющими на кислотность среды. На данном этапе была установлена максимальная рабочая концентрация Амфиэвовира, равная 20 мкг/мл. Для последующих экспериментов использовали разведения Амфиэвовира, значения которых составили 20 и 10 мкг/мл. Результаты экспериментов по определению противовирусной активности исследуемого препарата показаны на рис. 1–3. На рис. 1 представлены данные по изучению нейтрализующих свойств препарата вне клетки. Установлено, что препарат Амфиэвовир в концентрации более 10 мкг/мл снижает активность вируса бешенства при взаимодействии вне клетки, уровень редукции активности при использовании доз 10 и 20 мкг/мл соответствовал значениям 12,4 и 19,1% относительно инфицирующей активности вируса бешенства в контрольной группе. При этом коэффициент вариации составил не более 15%.
Рис. 1. Нейтрализующее действие Амфиэвовира на вирус бешенства (число экспериментов для каждой группы n=3) Fig. 1. Neutralizing effect of amphivoir on rabies virus (number of experiments for each group n=3)
Рис. 2. Исследование противовирусной активности на инфицированной культуре клеток (число экспериментов для каждой группы n=3) Fig. 2. Study of antiviral activity on infected cell culture (number of experiments for each group n=3)
Результаты экспериментов по исследованию влияния Амфиэвовира на инфицированную клеточную культуру показаны на рис. 2. В этой серии экспериментов изучали действие Амфиэвовира в дозах 20 и 10 мкг/мл. Препарат добавляли в клеточный монослой через 24 ч после начала инфицирования вирусом бешенства. Перед обработкой монослоя полностью удаляли питательную среду и однократно отмывали раствором Дульбекко. Аналогичную процедуру осуществляли для второй контрольной группы, в которую добавляли питательную среду без добавления Амфиэвовира. В первой контрольной группе замену среды не проводили. Результаты показали несущественные различия между двумя контрольными группами. Данное обстоятельство свидетельствует о том, что замена среды в инфицированном монослое практически не влияет на титр вируса бешенства, определяемый используемым методом. При этом в обеих опытных группах наблюдали значительное снижение титра вируса. Уровень редукции вирусной активности по сравнению с первой контрольной группой соответствовал значениям 24,6 и 36,2% для коцентраций Амфиэвовира 10 и 20 мкг/мл. Коэффициент вариации в настоящем эксперименте не превышал 5%. В следующем эксперименте, результаты которого представлены на рис. 3, оценивали эффект времени с момента инфицирования клеточной культуры до добавления исследуемого препарата. В экспериментах использовали концентрацию препарата, равную 20 мкг/мл. Препарат в исследуемой концентрации добавляли к клеточному монослою через 24, 48 и 72 ч после его инфицирования аналогично предыдущему эксперименту. Общий срок наблюдения составил 4 суток. Результаты, представленные на рис. 3, свидетельствуют, что противовирусное действие исследуемого препарата зависит от времени, прошедшего с момента инфицирования.
Рис. 3. Исследование противовирусного эффекта на инфицированной культуре клеток в зависимости от времени внесения (число экспериментов для каждой группы n=3) Fig. 3. Study of the antiviral effect on the infected cell culture depending on the time of application (number of experiments for each group n=3)
При этом наибольший противовирусный эффект имел место при более раннем воздействии на инфицированный объект. Так, добавление Амфиэвовира к монослою Vero через 24 ч после его инфицирования вирусом бешенства позволило снизить уровень репродукции последнего на 25%. Увеличение времени внесения до 48 ч снижало его эффективность практически в два раза, а обработка монослоя Амфиэвовиром через 72 ч после инфицирования практически не оказывала противовирусного воздействия.
ВЫВОДЫ
Препарат Амфиэвовир, изготовленный на основе комплекса однонитевой РНК S. cerevisiae в концентрациях от 10 до 20 мкг/мл, не оказывает токсического воздействия на клеточную культуру, снижает инфекционную активность вируса бешенства в условиях in vitro, а также задерживает его репродукцию в инфицированной культуре клеток Vero. Установлено, что эффект снижения репродукции вируса бешенства обратно зависит от срока инфицирования клеточной культуры. Полученные данные свидетельствуют о противовирусном действии исследуемого препарата in vitro в отношении вируса бешенства. Результаты позволяют обосновать дальнейшие исследования при изучении схем профилактики бешенства с использованием препаратов, изготовленных на основе иммуностимулирующих и иммуномодулирующих РНК. Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи. Conflicts of Interest. The authors declare no obvious or potential conflicts of interest related to the publication of this article.
ЛИТЕРАТУРА
1. Zheng J., Sui B., Zhao L. Rabies lyssavirus. Veterinary Virology of Domestic and Pet Animals. Cham: Springer Nature Switzerland, 2025; 1–19. 2. WHO Expert Consultation on Rabies, third report. Geneva: World Health Organization; 2018 (WHO Technical Report Series, No. 1012). 195 3. Lacy M., Phasuk N., Scholand S.J. Human Rabies Treatment – From Palliation to Promise. Viruses. 2024; 16(1): 160. DOI: 10.3390/v16010160 4. Ковалев Н.А., Бучукури Д.В. Изучение бешенства и разработка средств и способов его профилактики в Беларуси. Весці Нацыянальнай акадэміі навук Беларусі. Серыя аграрных навук. 2014; 4: 96–102. 5. Бучукури Д.В., Ковалев Н.А., Ломако Ю.В. и др. Вакциносодержащая безблистерная приманка для пероральной иммунизации плотоядных животных против бешенства. Известия Национальной академии наук Беларуси. Серия аграрных наук. 2019;
6. Yamada K., Noguchi K., Kimitsuki K., et al. Reevaluation of the efficacy of favipiravir against rabies virus using in vivo imaging analysis. Antiviral Res. 2019; 172: 104641. DOI: 10.1016/j.antiviral.2019.104641. 7. Wu J., Cao S., Lei S., et al. Clofazimine: a promising inhibitor of rabies virus. front pharmacol. 2021; 12: 598241. DOI: 10.3389/fphar.2021.598241. 8. Scott T.P., Nel L.H. Rabies prophylactic and treatment options: an in vitro study of sirna- and aptamer-based therapeutics. Viruses. 2021; 13(5): 881. DOI: 10.3390/v13050881 9. Brandão P.E., Castilho J.G., Fahl W., et al. Short-interfering RNAs as antivirals against rabies. Braz. J. Infect. Dis. 2007; 11(2): 224–225. DOI: 10.1590/s1413-86702007000200011. 10. Ермолаев В.В., Шимина Г.Г., Аликин Ю.С. и др. Новые препараты иммуномодуляторов на основе РНК для лечения вирусных инфекций. Инновации и продовольственная безопасность. 2023; 4: 78–89. DOI.org/10.31677/23110651-2023-42-4-78-89. 11. Даниленко Е.Д., Белкина А.О., Сысоева Г.М. Создание лекарственных препаратов на основе высокополимерных двуспиральных РНК для противовирусной и противоопухолевой
терапии. Биомедицинская химия. 2019; 65(4): 277–293. 12. Старков Ф.И., Шалин В.В., Миронов В.С., Миронов А.В. Милуокский протокол – от идеи до реализации. Медицинский вестник Юга России. 2023; 14(3): 59–65. DOI: 10.21886/2219-8075-2023-14-3-59-65. 13. Игнатьев Г.М., Шустова Е.Ю., Рогожина Е.А. и др. Противовирусная активность лекарственного препарата на основе РНК двуспиральной натриевой соли в отношении SARS-CoV-2 in vitro. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2023; 23(3): 290–299. DOI: 10.30895/2221-996X-2023-23-3-290-299. 14. Ямковая Т.В., Мазуркова Н.А., Загребельный С.Н. и др. Способ лечения оспы. Патент № 2480219. опубл. 27.04.2013. Бюл. №12. 15. Ямковая Т.В., Глотова Т.И., Колесникова О.П. и др. Легко проникающий через биологические мембраны мылкий амфифильный индуктор интерферона γ-перспективный препарат для лечения гепатита с человека. Сибирский научный медицинский журнал. REFERENCES 1. Zheng J., Sui B., Zhao L. Rabies lyssavirus. Veterinary Virology of Domestic and Pet Animals. Cham: Springer Nature Switzerland, 2025; 1–19. 2. WHO Expert Consultation on Rabies, third report. Geneva: World Health Organization; 2018 (WHO Technical Report Series, No. 1012). 195 3. Lacy M., Phasuk N., Scholand S.J. Human Rabies Treatment – From Palliation to Promise. Viruses. 2024; 16(1):160. DOI: 10.3390/v16010160 4. Kovalev N.A., Buchukuri D.V. Izuchenie beshenstva i razrabotka sredstv i sposobov ego profilaktiki v Belarusi. Vescі Nacyyanal'naj akademіі navuk Belarusі. Seryya agrarnyh navuk. 2014; 4: 96–102. (In Russ.). 5. Buchukuri D.V., Kovalev N.A., Lomako Yu.V. i dr. Vakcinosoderzhashchaya bezblisternaya primanka dlya peroral'noj immunizacii plotoyadnyh zhivotnyh protiv beshenstva. Izvestiya Nacional'noj akademii nauk Belarusi. Seriya agrarnyh nauk. 2019; 57(3): 334–343. (In Russ.). 6. Yamada K., Noguchi K., Kimitsuki K., et al. Reevaluation of the efficacy of favipiravir against rabies virus using in vivo imaging analysis. Antiviral Res. 2019; 172: 104641. DOI: 10.1016/j.antiviral.2019.104641. 7. Wu J., Cao S., Lei S., et al. Clofazimine: a promising inhibitor of rabies virus. front pharmacol. 2021; 12: 598241. DOI: 10.3389/fphar.2021.598241. 8. Scott T.P., Nel L.H. Rabies prophylactic and treatment options: an in vitro study of sirna- and aptamer-based therapeutics. Viruses. 2021; 13(5): 881. DOI: 10.3390/v13050881 9. Brandão P.E., Castilho J.G., Fahl W., et al. Short-interfering RNAs as antivirals against rabies. Braz. J. Infect. Dis. 2007; 11(2): 224–225. DOI: 10.1590/s1413-86702007000200011. 10. Ermolaev V.V., Shimina G.G., Alikin Yu.S. i dr. Novye preparaty immunomodulyatorov na osnove RNK dlya lecheniya virusnyh infekcij. Innovacii i prodovol'stvennaya bezopasnost'. 2023; 4: 78–89. DOI.org/10.31677/2311-0651-2023-42-4-78-89. (In Russ.).
